外周血 CD34+干细胞

CD34+干细胞是多能的，可以产生血液中的所有细胞类型。 CD34+细胞主要存在于骨髓和脐带血。动员外周血CD34+干细胞，是通过免疫细 胞磁珠分离的方法从动员外周血单个核细胞中分离出来。 正确地复苏冻存细胞是保证细胞功能与活力的关键，采用正确快速的操作手法以确保细胞有更高的存活率。

试剂耗材 

缓冲液：PBS或DPBS、0.5% HSA或FBS（比例视需求可调整） 

其他：75% 酒精、15ml离心管、50ml离心管、巴氏滴管、止血钳、一次性无菌薄膜 PE手套 

设备 恒温水浴锅、生物安全柜、液氮罐、微量移液器、离心机

操作步骤 1. 在37℃水浴锅中预热缓冲液和培养基。

2. 从液氮罐中取出细胞，止血钳夹住冻存管帽，在 37°水浴中缓慢摇晃。水面高度一定要达到冻存液的液面高度。为防止污染，水浴解冻时注 意液面不能漫过冻存管的盖子接触口（防止污染）。

3. 根据冻存管规格大小，解冻时间大约为 1.5-2min。规格大，可适当延长解冻时间。化冻标准:有且只有一点冰晶（一定不能残留多，严重影 响活率；切勿化过头）。 

4. 当管子内还保留少量冰晶时将冻存管移出水浴锅，用75%的酒精进行消毒，无菌纸擦拭，然后迅速转移到生物安全柜中。

5. 操作台内，提前先在无菌 15ml 离心管中加入 6-8ml Buffer，将冻存管打开，加少量 Buffer 于冻存管中，稀释细胞并转移至 15m|离心 管，并在 15ml 离心管 Buffer 中润洗枪头 2-3 次。吸取新的 Buffer 润洗冻存管，转移至 15m|离心管 (可直接弃枪头)。冻存管润洗 2- 3 次，尽量不接触管口避免污染。 

6. 补 Buffer 至 14ml，混匀，取一部分细胞进行计数活力检测。

7. 将离心管中的细胞 400g、10min 室温离心（离心条件可根据离心管类型、实验需求进行调整，推荐如下表格）。 *推荐离心条件： 细胞规格 10M 25M 50M 100M 离心管推荐 15ml 15ml 15ml 50ml Buffer 加样量 14ml 14ml 14ml 45ml 离心转数/时间 400g 10min 400g 10min 400g 10min 400g 10min 定容体积 2ml 5ml 10ml 20ml 浓度范围 5-7*10^6 cells/ml

8. 巴氏滴管吸弃清液，残留 1-2ml，改用移液枪吸弃（无菌操作，避免吸到细胞）。

9. 加入 2-3ml Buffer，轻缓吹散细胞混匀，再补适量 Buffer 混匀。（一次性加较多液体混匀时可能会吹打不均匀或成团较多，故可选择 分次加液仅供科学研究使用 2 / 2 

10. 然后取适量细胞进行细胞计数与活力检测。 

11. 使用低吸附材质的容器，推荐用一次性无菌薄膜手套，先取染液，再取等体积细胞悬液混匀，取样计数。

12. 根据实验需求将细胞悬液转移到适当的培养皿或者培养瓶中，以待进一步使用。 

注意事项 

1. 在速溶细胞时，可用 PE 手套包裹住冻存管进行溶解，防止污染。 

2. 复苏时，建议放气操作：即拿出细胞，旋开 1/4 盖迅速拧紧，立即化冻（由于冻存体积少，管内上部分空气较多，液氮挥发产生较大 压力，放气操作，能缓冲对细胞的冲击损伤）。

3. 操作尽可能轻缓，避免机械损伤，润洗冻存管过程中可逐滴加入缓冲液，减少气泡产生。 

4. 细胞离心前后一定要进行细胞计数。离心后观察细胞上清液澄清度及底部细胞沉淀量；初步判断评估细胞是否有严重损失。 

5. 可观察底部沉淀量并用显微镜观察离心上清液，用于分析细胞的损失情况。 由于每个实验室的计数方法不一样，可能会产生偏差。

6. 计数要点: 

①取样时样本一定要混合均匀；

②稀释的样本浓度建议 10^6-10^7/ml 之间；

③稀释原则：尽可能取的细胞原液多，先加好 稀释液，再加细胞液；

④采用低吸附的枪头等耗材（推荐在 PE 手套上使用，以减少粘附。） 

培养基请参考下表，不同实验所需添加因子有差异，请依据实验需求调整培养方案。

Cell Type Media Cytokine Mononuclear cells RPMI* AIMV CD3+ Pan T cells RPMI* AIMV IL-2 CD4+ T cells RPMI* AIMV IL-2 CD8+ T cells RPMI* AIMV IL-2 CD19+ B cells DMEM RPMI* α-MEM X-VIVO NK cells DMEM RPMI* SCGM Medium IL-2 IL-15 Neutrophils RPMI 1640 (supplemented) G-CSF GM-CSF CD34+ stem/progenitor cells RPMI 1640 (supplemented) SCF IL-3 IL-6 CD14+ Monocytes DMEM RPMI* GM-CSF (M1 M0) M-CSF (M1 M0) IL-4 + GM-CSF (dendritic cells) Dendritic cells RPMI* IL-4 GM-CSF